PLAQUEAR CÉLULAS DE UM JEITO FÁCIL: CONTAGEM COM PLANILHA AUTOMÁTICA
Seu plaqueamento de células mais rápido e mais preciso
Descrição completa do método de contagem de células em câmara de Neubauer, com dicas importantes e tabela automatizada que irá te poupar muito tempo.
Por: Diego Mauro Carneiro Pereira
CONTAGEM DE CÉLULAS COM HEMOCITÔMETRO/CÂMARA DE NEUBAUER
Introdução
O hemocitômetro ou câmara de Neubauer é uma lâmina especializada utilizada para contagem celular com o auxílio de um microscópio. Existem diversos tipos de hemocitômetros, cada um com uma grade de contagem diferente. O mais comumente utilizado é a câmara ‘Improved Neubauer’.
Antes de iniciar a contagem celular com o hemocitômetro, é necessário realizar uma preparação. Comece coletando uma amostra representativa da população celular. Para garantir que sua amostra seja representativa, resuspenda a solução pipetando para cima e para baixo algumas vezes antes de retirar a amostra.
Apesar dos avanços tecnológicos recentes nos laboratórios científicos, a câmara de Neubauer continua sendo um dos métodos mais comuns para contagem celular em todo o mundo. Embora as dimensões e volumes específicos possam variar, os princípios descritos aqui se aplicam a qualquer tipo de câmara de contagem celular. Este manual aborda as melhores práticas, aplicações e recomendações para realizar a contagem celular de forma eficiente.
Passo 1 – Preparação da Amostra
Se houver muitas ou poucas células na sua câmara de contagem, isso afetará a contagem celular. Se houver muitas células, a contagem pode ser mais difícil, resultando em erros. No entanto, se houver poucas células, você pode esperar mais erros aleatórios. A concentração recomendada de células para contagem com um hemocitômetro é cerca de 10^6 células/ml. Usando uma câmara Improved Neubauer, a faixa ideal de concentração de células é de 2,5 × 10^5 a 2,5 × 10^6 células/ml. Como resultado, pode ser necessário diluir ou concentrar sua amostra antes da contagem.
Passo 2 – Pipetando na Câmara de Neubauer
Com uma micropipeta, pegue 10 µl da diluição preparada no Passo 1. Coloque a lâmina de vidro sobre a área central da câmara de Neubauer. Certifique-se de que a câmara está sobre uma superfície plana, como uma mesa. Carregue a micropipeta com 10 µl e transfira cuidadosamente a amostra para a câmara, posicionando a ponta da pipeta perto da borda da lâmina de vidro. A amostra será absorvida pela câmara por capilaridade. Evite a formação de bolhas de ar e assegure-se de que a lâmina de vidro permaneça estável. Se necessário, repita o procedimento para garantir o carregamento adequado.
Passo 3 – Preparação e Foco no Microscópio
Coloque a câmara de Neubauer na platina do microscópio. Se o microscópio tiver uma braçadeira de fixação, fixe a câmara de Neubauer nela. Ligue a luz do microscópio. Ajuste o foco do microscópio até que a imagem das células fique nítida ao olhar através da ocular e ajustando a platina.
Anote a quantidade de células contadas nos quadrantes
Passo 4 – Cálculo da Concentração
Aplicamos a fórmula para o cálculo da concentração:
Concentração (células/ml) = Número de células / Volume (em ml)
O número de células será a soma de todas as células contadas em todos os quadrados.
Portanto, para a câmara de Neubauer, a fórmula usada para a contagem nos quadrados é:
Concentração = Média dos quadrantes x 10.000 células
Onde a média dos quadrantes é = Q1 + Q2 + Q3 + Q4 / 4.
Se você diluir suas células, anote o fator de diluição para poder calcular a concentração de células na amostra original mais tarde.
Nesse caso, a concentração deverá ser multiplicada pela diluição aplicada. A fórmula será:
Concentração = (Média dos quadrantes * 10.000) * fator de diluição
Exemplo:
Para uma diluição 1:10 → fator de diluição = 10
Para uma diluição 1:100 → fator de diluição = 100
Contagem de células para plaqueamento
Considerando que você obteve a quantidade de células através da câmara de Neubauer, você pode utilizar esse valor para calcular o volume necessário para atingir um número específico de células para o plaqueamento. Abaixo, você verá como calcular a quantidade de células necessária para o plaqueamento. Preencha os campos abaixo para obter tanto o valor total de células na contagem quanto a quantidade de microlitros a ser pipetada para o plaqueamento.
Para acessar um eBook com a descrição completa do método de contagem de células em câmara de Neubauer, dicas importantes (extras) e uma planilha automatizada que vai te economizar muito tempo, clique no link do botão abaixo. Na planilha, você insere apenas a contagem de células, o número por quadrante ou a soma, e ela calcula automaticamente o volume necessário para plaquear a quantidade de células indicada. Confira um modelo da planilha com amostra grátis para calcular uma linhagem clicando aqui. Para acessar a versão completa da planilha, com todos os recursos que fazem os cálculos automaticamente, e o eBook completo, clique no botão abaixo
Tabela automatizada para contagem de células
Visto que cálculos e organização podem tomar muito tempo, um bem precioso, foi desenvolvida uma tabela para automatizar a contagem e facilitar o seu trabalho.
Ao acessar a planilha, crie uma cópia. Uma sugestão é salvar essa cópia em um diretório específico do seu Google Drive. A cada experimento, crie uma nova cópia, assim você mantém todos os dados organizados e salvos.
Dentro do arquivo, você encontrará 3 planilhas:
- Planilha 1 – Contagem de 1 linhagem simples: Nível básico, destinado a uma contagem única.
- Planilha 2 – Contagem simples várias linhagens: Nível intermediário, permitindo contar várias linhagens/experimentos.
- Planilha 3 – Contagem completa: Oferece diversas informações, como número de células, quantidade de µL gastos e acesso a vários experimentos e linhagens.
Em todas as planilhas, preencha apenas o que estiver em verde, e não preencha o que estiver em vermelho. Na Planilha 1 e Planilha 2, as cores estão indicadas como fundo no texto. Na Planilha 3, as cores verde e vermelho estão no texto.
Campos opcionais: Quando um campo estiver marcado como opcional, você não precisa preenchê-lo para obter os resultados da contagem. Porém, para acessar informações mais detalhadas sobre a quantidade de células e volumes específicos, esses campos são necessários.
- Na Planilha 1, você deve preencher campos como: qual é a sua linhagem, em quantos µL você ressuspendeu a amostra, qual o fator de diluição (calculado conforme indicado acima), o valor da contagem e, o mais importante, quantas células você deseja plaquear (no campo “Quantidade de células”). Ao indicar a quantidade de células, a tabela calcula automaticamente quantos µL você deve pegar da suspensão para atingir a quantidade de células desejada.
- Na Planilha 2, Contagem simples para várias linhagens, você terá acesso aos mesmos recursos da Planilha 1, mas agora pode inserir quantas linhagens desejar e também fazer cálculos para mais de um experimento ou testar diferentes quantidades de células em um mesmo experimento.
- Na Planilha 3 – Contagem completa:
Na Planilha 3, além dos recursos da Planilha 1 e Planilha 2, você encontrará funcionalidades adicionais que a tornam mais robusta:- Verificar a quantidade de amostra utilizada:
Na coluna C, você pode inserir se o experimento será realizado em simplicata (1) ou triplicata (3), por exemplo. A tabela calculará na linha 7 a quantidade de suspensão utilizada em µL e na linha 8 a quantidade de células em unidades. Também será possível visualizar na linha 9 quantas células sobraram, caso deseje utilizá-las para outra finalidade. - Utilizar uma quantidade específica na hora de pipetar:
Caso precise pipetar um volume específico para o seu experimento, isso pode ser determinado e calculado automaticamente na tabela. Por exemplo, você pode querer pipetar 150 µL de amostra já diluída em meio em cada poço. Para isso, você pode diluir previamente a amostra no meio de cultura e pipetar apenas a quantidade desejada. Alguns campos da planilha são marcados como opcionais, pois não são necessários para a contagem padrão. Porém, nesse caso, será necessário preenchê-los para utilizar quantidades específicas de amostra.
- Verificar a quantidade de amostra utilizada:
Na coluna A, você verá os números dos experimentos, que podem ser usados para selecionar a quantidade exata de amostra para ser pipetada.
Nas linhas 10, 11 e 12, são mostrados os valores de meio e amostra necessários para criar um pool contendo a quantidade de células indicada. Para o cálculo funcionar, você deve preencher na coluna D a quantidade de µL que deseja pipetar por poço.
Ao selecionar se o experimento será em simplicata (coluna C), você pode adicionar poços extras para eventuais erros de pipetagem, se necessário. Na célula F11, você deve indicar o número do experimento para o qual deseja pipetar quantidades específicas. A tabela será atualizada automaticamente quando você alterar o número do experimento na célula F11.
Para informações mais detalhadas com imagens, considere acessar o eBook + Planilha Completa na versão PRÓ.